Eine Möglichkeit zur Angleichung der spektralen Eindringtiefen des evaneszenten Feldes in der TIRF Mikroskopie

Die TIRF Mikroskopie hat in den vergangenen Jahren immer mehr an Bedeutung zugenommen, da mit diesem Verfahren wesentlich die z- Auflösung verbessert werden kann. Dabei wird folgender Sachverhalt ausgenutzt. Eine Beleuchtung wird unter einen so großen Winkel der Probe zugeleitet, dass der Flächendurchtritt vom Deckglas zur Probe infolge von Totalreflexion nicht möglich ist. Lediglich das bei Totalreflexion entstehende evaneszente Feld dringt einen kleinen Betrag in die Probe ein und beleuchtet die unmittelbar am Deckglas liegende Schicht. Die Eindringtiefe der evaneszenten Welle in die Probe ist von der Lichtwellenlänge abhängig. Dadurch ergeben sich bei Multi- Color TIRF Anwendungen mit herkömmlichen Lichteinspiegelungen erhebliche Nachteile bezüglich der Erkennbarkeit und Detektionsfrequenz einzelner Fluorophore oder Farbstoffe. Mit der vorgestellten Methode können die spektralen Eindringtiefen bei Multi Color Anwendungen angeglichen werden, wodurch sich für alle verwendeten Wellenlängen annähernd gleiche Anregungsvolumen ergeben.